一般生物體中的的RNA中，rRNA占絕大多數(shù)，含量超過90%，而mRNA的含量在1-2%，左右，轉(zhuǎn)錄組測序文庫是以樣本的Total RNA為基礎(chǔ)，從中提取mRNA構(gòu)建測序文庫，因此文庫構(gòu)建包括mRNA富集和碎片化、mRNA反轉(zhuǎn)錄、接頭添加和PCR富集等過程。
mRNA富集
在生物的Total RNA中，mRNA所占比例很低，絕大部份時核糖體RNA (rRNA)，因此如果直接使用Total RNA進行測序，得到的結(jié)果必然是不準確的，因此需要先將Total RNA中的mRNA分類純化出來。
轉(zhuǎn)錄組測序的文庫根據(jù)待測樣品的物種分為真核轉(zhuǎn)錄組和原核轉(zhuǎn)錄組。由于真核生物和原核生物mRNA結(jié)構(gòu)不同，因此在mRNA富集時所采用的方法也并不相同。
真核生物mRNA中含有polyA尾結(jié)構(gòu)，因此可以使用oligoT與其特異性的匹配，從而在Total RNA中特異性的富集mRNA。
然而，原核生物并不像真核生物mRNA具有polyA的結(jié)構(gòu)，因此，無法直接利用oligoT將mRNA純化出來，目前，提高原核生物中mRNA的量，最主要的方式是去除Total RNA中rRNA。
由于測序儀器不能直接對RNA測序，所以還要反轉(zhuǎn)錄成cDNA
鏈特異性文庫
由于轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建過程中要將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈的cDNA，因此，在測序時，即會同時得到cDNA雙鏈的序列信息，這就消除了mRNA單鏈的特性，無法區(qū)分cDNA中的正義鏈和反義鏈。
因此提出了另一種文庫構(gòu)建方式，鏈特異性文庫，其在文庫制備和測序中保留mRNA 的方向信息，使得有效數(shù)據(jù)增多，基因表達定量更準確；基因注釋更準確，新基因識別等分析更可靠；同該方法能夠鑒定與開放閱讀框反義的ncRNA、發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)錄本。
其建庫原理與普通轉(zhuǎn)錄組類似，不同之處在于合成第二鏈cDNA時，用dUTP代替dTTP，此時第二鏈cDNA上布滿了含dUTP的位點。
在接頭連接后用一種特定的酶，其可在尿嘧啶位置產(chǎn)生一個單核苷酸缺口，從而消化掉第二鏈cDNA，只保留第一鏈cDNA，隨后進行PCR擴增純化，得到只含第一鏈cDNA信息的文庫。
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